Ressources techniques

R. Le type de tampon utilisé pour traiter l’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose dépend principalement de la taille du fragment d’ADN et de l’application post-électrophorèse. Deux tampons fréquemment utilisés pour l’électrophorèse d’ADN sur gel d’agarose sont le Tris-Acétate avec EDTA (TAE, Tris-Acétate 40 mM, EDTA 1 mM) et le Tris-Borate avec EDTA (TBE, Tris-Borate 89 mM, EDTA 2 mM). Étant donné que le pH de ces tampons est neutre, le squelette phosphate de l’ADN a une charge nette négative et migre vers l’anode.

Le TAE et le TBE ont des propriétés différentes et conviennent donc chacun mieux pour des utilisations spécifiques. Pour les fragments d’ADN de grande taille (> 10 kb), le TAE est la meilleure option. Pour les fragments d’ADN plus petits (< 1 kb), le TBE est généralement préférable car il dispose d’une capacité de tampon plus importante et permettra d’obtenir une résolution plus fine qu’avec le TAE. Le TAE est également le tampon de préférence lorsque l’échantillon d’ADN est utilisé dans des expériences de clonage, le borate du TBE constituant un puissant inhibiteur de nombreux enzymes.

R. L’épaisseur recommandée de gel d’agarose est de 3 à 4 mm. Les gels plus épais que 5 mm donneront des bandes floues.

R. L’agarose Fisher BioReagents réf. 10766834, de qualité biologie moléculaire, convient bien pour la séparation de routine de l’ADN et de l’ARN dans une plage allant de 500 bp à 23 kb. Pour la séparation de fragments dans une plage allant de 100 à 2 000 bp, nous suggérons le Fisher BioReagents réf. 10766834, en augmentant la concentration de gel (> 2 %) et en utilisant le tampon TBE (pas le TAE).

R. Le test des comètes (électrophorèse sur gel à cellule unique) est une méthode simple utilisée pour mesurer les cassures de brins d’ADN dans les cellules eucaryotes. Il est généralement nécessaire d’utiliser un agarose à bas point de fusion. Nous suggérons le Fisher BioReagents réf. 10377033, un agarose de qualité biologie moléculaire à bas point de fusion qui est idéal pour la séparation et la récupération des acides nucléiques.

R. Vous ne devriez pas charger plus de 100 ng d’ADN. Cette quantité devrait vous donner une bande claire et bien définie lorsque vous la colorez au bromure d’éthidium et l’examinez sous une lampe UV. Si vous chargez trop d’ADN, vous verrez une tache.

R. Les colorants de charge Fisher BioReagents réf. 10205023, colorant de charge de gel d’agarose, 6X sont composés d’un mélange unique de trois colorants de suivi qui permettent d’évaluer la migration d’échantillon de manière simple et fiable:

• Colorant n° 1 – un colorant bleu clair qui migre à environ 4 000 paires de bases dans un agarose à 1%
• Colorant n° 2 – un colorant indigo qui migre à environ 600 paires de bases dans un agarose à 1%
• Colorant n° 3 – un colorant magenta qui migre à environ 10 paires de bases dans un agarose à 1%.

R. La tension recommandée est de 4 à 10 volts/cm (le nombre de cm est déterminé en mesurant la distance interélectrode, c’est-à-dire la distance entre l’anode et la cathode, et non la longueur du gel) dans des conditions normales d’électrophorèse. Si la tension est trop faible, la mobilité des petits fragments d’ADN (< 1 000 bp) s’en trouve réduite et la diffusion causera un élargissement de la bande. Si la tension est trop élevée, la résolution de la bande est réduite, principalement à cause de la surchauffe du gel.

A. Recirculation prevents the formation of pH gradient and buffer depletion, so it is advisable to recirculate the buffer especially during extended electrophoresis. Buffer recirculation is also important when running larger TAE gels due to the lower buffering capacity of TAE.

R. Des sachets de décoloration de bromure d’éthidium sont disponibles, Fisher Bioreagents réf. 12861680. Ces sachets enlèveront jusqu’à 5 mg de bromure d’éthidium lorsqu’ils sont agités avec une solution pendant une nuit. Cependant, étant donné que les réglementations sur les déchets peuvent varier, contactez votre responsable de sécurité local pour des consignes d’élimination.

R. Nous ne disposons pas d’informations concernant la quantité d’ADN dans chaque fragment (bande) de Fisher BioReagent réf. 10284633, marqueur de taille moléculaire ADN à basse échelle (100 bp). Le marqueur de taille moléculaire ADN est conçu comme un étalon polyvalent de détermination de la taille des fragments d’ADN comme les amplicons PCR séparés sur mini gel d’agarose. Il n’est pas conçu pour une utilisation comme étalon quantitatif. Cependant, pour la quantification, nous proposons les marqueurs de taille moléculaire ADN exACTGene tels que le Fisher Bioreagents réf. 10021463, ce marqueur de taille moléculaire ADN de plage basse mesure la quantité approximative d’ADN contenue dans chaque bande.

R. Il convient d’être attentif à sélectionner le pourcentage d’acrylamide ou la porosité appropriés de gel à utiliser. Le tableau ci-dessous détaille le pourcentage de gel à utiliser pour séparer les tailles de protéines indiquées..

Pourcentage d’acrylamide	Résolution de séparation
5%	60 to 220kDa
7.5%	30 to 120kDa
10%	20 to 75kDa
12%	17 to 65kDaa
15%	15 to 45kDa
17.5%	12 to 30kDa

R. Pour l’électrophorèse sur gel protéinique, des tampons de charge d’échantillon type sont disponibles en formulation réductrice ou non réductrice. Le dithiothréitol (DTT) est un agent réducteur commun utilisé dans les tampons d’échantillon de protéines. La formulation du Fisher BioReagents réf. 10376363, colorant de charge de gel protéinique (2X), ne contient pas d’agent réducteur tel que le DTT.

R. Il est déconseillé d’autoclaver le Fisher BioReagent réf. 10204733, 10X PBS, car du phosphate pourrait se séparer par précipitation. Pour ce produit, nous filtrons la solution tampon à travers un filtre 0,2 micron dans un flacon poly stérile 1 L sous une hotte stérile.

R. La formulation du produit Fisher BioReagents réf. 10649743, solution saline dans un tampon phosphate (PBS), solution 10X, est la suivante:

• 1,37 M de chlorure de sodium
• 0,027 M de chlorure de potassium
• 0,119 M de tampon phosphate

Le tampon phosphate contient deux composants, à savoir 0,101 M phosphate de sodium dibasique heptahydraté (CAS n° 7782-85-6) et 0,018 M de phosphate de potassium monobasique (CAS n° 7778-77-0).

R. Le Western Blotting est basé sur la séparation des protéines en fonction de leur taille sur un gel. Cependant, la migration des protéines dans la matrice du gel est également affectée par d’autres facteurs, ce qui peut résulter en des différences entre la taille de bande observée et la taille prédite. Les causes fréquentes sont :

• La modification post-traductionnelle – par exemple la phosphorylation et la glycosylation augmentent la taille de la
• Le clivage post-traductionnel – beaucoup de protéines sont synthétisées comme protéines précurseures, puis clivées pour donner la forme active
• Les multimères – par exemple la dimérisation d’une protéine. Dans des conditions de réduction, ce phénomène est généralement évité, même si des interactions fortes peuvent faire apparaître des bandes plus élevées
• Variantes d’épissage – un épissage alternatif peut produire des protéines de différentes tailles à partir d’un même gène
• Charge relative – la composition des acides aminés (chargés vs non chargés).

R. La coloration au Coomassie est probablement l’une des techniques les plus connues de coloration de protéines. Il existe deux méthodes principales de coloration au Coomassie, le Coomassie classique et le Coomassie colloïdal, mis au point plus récemment.

• Le Coomassie classique implique de colorer la totalité du gel, pas uniquement les protéines. En décolorant le gel, on visualise les protéines, étant donné que le colorant est mieux conservé par les protéines que par le gel. Sa sensibilité (limite de détection) est d’environ 100 ng, ce qui rend difficile la détection de protéines peu abondantes. C’est une méthode simple, bon marché et rapide qui présente l’avantage d’être compatible avec la spectrométrie de masse. Cependant, la reproductibilité est problématique avec cette coloration, en raison des difficultés à standardiser l’étape de décoloration.
• Le Coomassie colloïdal est une adaptation de la coloration classique au Coomassie, qui utilise un colorant de Coomassie modifié (G-250 au lieu du R-250). Il a une sensibilité accrue par rapport au Coomassie classique, avec une limite de détection d’environ 10 ng. Il est facile à effectuer et comme le colorant colloïdal ne pénètre pas le gel, la décoloration n’est pas nécessaire (elle peut toutefois être utilisée pour améliorer le fond). Comme le Coomassie classique, il est compatible avec la spectrométrie de masse.

En plus de la coloration au Coomassie, la coloration à l’argent est une autre méthode fréquente de visualisation des protéines. Le principal avantage de la coloration à l’argent est sa sensibilité élevée, qui permet de détecter moins de 1 ng de protéines, ce qui en fait la méthode de prédilection pour la détection de protéines peu abondantes. La coloration à l’argent est toutefois une méthode longue et difficile. Le gel doit être développé après la coloration pour pouvoir visualiser les protéines, et la durée du développement peut varier fortement d’un gel à l’autre, ce qui rend difficile la reproductibilité. La coloration à l’argent implique aussi l’utilisation de formaldéhyde pour fixer le gel, ce qui la rend incompatible avec la spectrométrie de masse.

R. Oui, il est possible de colorer au Coomassie ou au bleu colloïdal avant un Western Blotting, bien que l’efficacité du transfert et donc du sondage puisse s’en trouver réduite. Il convient toutefois de noter que cela n’est généralement recommandé que si vous utilisez une coloration colloïdale. Pour garantir une efficacité de transfert optimale, décolorez le gel puis équilibrez à l’aide d’une série de solutions de base Tris / glycine / SDS pour accroître la solubilité. Lorsque le transfert est terminé, traitez la membrane avec du méthanol afin d’enlever la coloration avant le développement chromogène (pas nécessaire avant une détection chimiluminescente).

R. Voici quelques options pour obtenir une meilleure efficacité de transfert pour les protéines de plus grande taille :

1. Pré-équilibrez le gel avec du SDS 0,02 à 0,04 %, dans un tampon de transfert 2X sans méthanol pendant 10 minutes avant d’assembler le sandwich.
2. Augmentez graduellement la durée du blotting (par intervalles de 15 min).
3. Ajoutez 0,01 % ou 0,02 % de SDS au tampon de transfert pour faciliter la migration de la protéine hors du gel.
4. Réduisez le contenu de méthanol dans le tampon de transfert.
5. Passez à un gel de pourcentage inférieur plus adapté. Un gel de pourcentage inférieur peut permettre un meilleur transfert qu’un gel à pourcentage élevé.

R. Il y a deux facteurs à prendre en compte : un mauvais transfert et le passage du marqueur à travers la membrane lors du transfert. En cas de mauvais transfert sur la membrane, envisagez les solutions suivantes:

• Le pourcentage d’acrylamide doit être de 8 % pour obtenir un transfert rapide et plus complet de protéines à poids moléculaire élevé.
• Augmentez la tension, l’intensité ou la durée du transfert.
• Pour un transfert vers le PVDF, abstenez-vous d’ajouter du SDS au tampon de transfert. L’ajout de SDS (ou l’utilisation d’un vieux tampon qui a pu être contaminé au SDS par le gel) fera que les protéines se lieront moins efficacement aux membranes PVDF, parce qu’il inhibe l’interaction hydrophobe entre la membrane et la protéine.
• Si le problème est que la protéine reste dans le gel, envisagez l’une des solutions suivantes:
  • Augmentez la concentration de SDS à 0,1 % (mais utilisez de la nitrocellulose).
  • Éliminez le méthanol du tampon.
  • Réduisez le pourcentage d’acrylamide.
  • Transférez pendant plus longtemps.

Si le marqueur passe à travers la membrane pendant le transfert.
• Réduisez la tension ou le transfert.
• Vérifiez la concentration de SDS ou de méthanol. Un excès de SDS peut empêcher la liaison à la membrane. L’alcool augmente la liaison hydrophobe à la membrane, une quantité d’alcool insuffisante peut empêcher la liaison.
• Utilisez une porosité de 0,2 µm de nitrocellulose.
• Vérifiez le pourcentage de gel, des protéines de plus petite taille passeront plus facilement à travers les membranes.

R. Le tampon le plus communément utilisé est le tampon RIPA avec SDS. La formulation habituelle est la suivante : 150 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,2, 0,1 % SDS, 1,0 % Triton X-100, 1 % désoxycholate, 5 mM inhibiteurs de protéases EDTA : 1 mM fluorure de phénylméthylsulfonyle, 10 mM benzamidine, 2 μg/ml inhibiteurs de phosphatase leupeptine : 100 µM orthovanadate de sodium, 10 mM p-nitrophénylphosphate

Procédure:
1. Placez les cellules sur la glace.
2. Lavez les cellules au PBS glacé pour enlever les milieux de culture.
3. Ajoutez 1 ml de tampon RIPA à une boîte de 100 mm. Si nécessaire, augmentez ou diminuez l’échelle.
4. Versez les cellules dans le tampon RIPA en grattant et transférez dans un petit tube à centrifuger.
5. Posez sur la glace pendant 10 min, en mélangeant au vortex à intervalles de quelques minutes pour dissoudre le matériau. Les lysats peuvent également être passés dans une aiguille 22 G pour faciliter la solubilisation.
6. Centrifugez à 17 000 tr/min pendant 10 min.
7. Enlevez le surnageant pour les dosages de protéines et jetez le culot.

REMARQUE : Pour les expériences pour lesquelles il n’est pas souhaitable de dénaturer complètement les protéines et d’éventuellement briser les interactions entre protéines, il est possible de remplacer le tampon RIPA par un tampon de solubilisation non dénaturant NP40. Recette : 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,5, 1 % NP40 ou 1 % Triton-X-100 et 5 mM EDTA. Si ce tampon non dénaturant est utilisé, il est nécessaire d’homogénéiser les lysats ou de les passer dans une aiguille à plusieurs reprises, afin de garantir une solubilisation adéquate.

R. Optimisez la concentration d’anticorps primaires et secondaires. Dans certains cas, augmenter la concentration d’agents de blocage (BSA ou poudre de lait écrémé) permet de réduire le signal de bruit de fond. Après incubation avec l’anticorps primaire, lavez au moins deux fois au TBST (incluez 0,5 M de NaCl dans une ou plusieurs étapes du lavage). Évitez d’utiliser du Nonidet™ P40 ou du Triton™ X-100 dans les tampons car ces détergents réduisent la détection des protéines.

R. Oui, la réf. 12737119 (albumine de sérum bovin, traitée par choc thermique de fraction V) peut être utilisé dans le cadre de plusieurs applications de biologie moléculaire, dont les Western blots (comme agent de blocage) et l’ELISA comme stabilisateur des réactions enzymatiques. Vous pouvez également envisager un autre produit BSA plus récent, la réf. 12871630 (BSA, traité par choc thermique et sans protéase). Ce produit a été utilisé de manière fructueuse pour des RIA et ELISA ainsi que comme agent de blocage.

R. Pour le stockage, après le transfert, séchez le blot à l’air et placez-le entre deux feuilles de papier-filtre propres. Placez le sandwich de papier-filtre et de blot entre deux feuilles de carton, afin de le maintenir à plat, et placez-le dans un sac en plastique scellable. Il est possible de stocker le blot à 4 °C jusqu’à deux semaines, à -20 °C jusqu’à deux mois ou indéfiniment à -80 °C. Lorsque vous êtes prêt à resonder, prémouillez le blot avec de l’alcool pendant quelques secondes, puis rincez-le à quelques reprises à l’eau pure afin de réduire la concentration d’alcool.

Pour déshydrater le blot:
• Dans une hotte d’aspiration, immergez le blot dans un tampon de déshybridation (100 mM ß-mercaptoéthanol, 2 % SDS, 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,7) et incubez à 50 °C pendant 30 minutes en agitant de temps en temps.
• Lavez 2 x 10 min au TBS-T/PBS-T à température ambiante.
• Bloquez la membrane en l’immergeant dans 5 % de réactif de blocage TBS-T ou PBS-T pendant 1 heure à température ambiante.
• Passez à la série suivante d’immunodétections.

• Souvent un traitement aussi rude n’est pas nécessaire pour enlever les anticorps de leurs protéines. Une méthode alternative et plus douce pour déshybrider un blot consiste à diminuer le pH du tampon de déshybridation.

R. Puissance (W) = tension (V) x intensité (A)
Résistance (Ω) = tension (V) / intensité (A)

R. La résistance d’une unité d’électrophorèse dépend de sa taille, de l’épaisseur du gel, de la quantité de tampon, de la conductivité du tampon et de la température. Cette résistance diminuera normalement avec le temps en raison d’une lente augmentation de la température. Les unités d’électrophorèse qui ont une résistance inférieure à la résistance de charge minimale d’une alimentation électrique déclencheront une alarme ! Relevez la tension de sortie et l’intensité lors d’une utilisation pour mesurer la résistance et utilisez la formule ci-dessus pour en calculer la valeur.

R. Il est possible que les paramètres que vous avez programmés diffèrent de ceux qui sont décrits ou que la résistance de votre unité d’électrophorèse diffère (voir ci-dessus). En revanche cela ne peut pas être dû, par exemple, à un autre modèle d’alimentation électrique, étant donné que les liens entre tension, intensité, puissance et résistance sont surveillés de la même manière pour n’importe quel instrument.

R. Si les sorties sont en parallèle, chaque unité d’électrophorèse sera alimentée avec exactement la même tension. Il est toutefois possible que l’intensité et la puissance soient différentes, compte tenu des différences entre les unités, même en utilisant les mêmes modèles, gels, tampons, etc. Il est donc recommandé d’utiliser uniquement le mode de tension constante si l’on souhaite faire fonctionner plusieurs unités d’électrophorèse sur une même alimentation électrique.

A. L’électrophorèse à des tensions élevées produit de la chaleur. De plus, des tampons à conductivité élevée comme le TAE génèrent davantage de chaleur que des tampons à faible conductivité. Il convient d’être prudent lors d’une électrophorèse sur gel d’agarose à des tensions supérieures à 175 V, car la chaleur engendrée peut produire des artefacts de gel tels que des fronts de migration en S, et lors d’électrophorèses de longue durée, elle peut même faire fondre le gel d’agarose. Lors d’une électrophorèse à haute tension, il convient d’éviter d’utiliser des gels d’agarose à point de fusion bas.

R. Un certain nombre d'électrodes pourraient convenir, mais ce qui importe est qu'il s'agisse d'une électrode « double jonction ». Consultez le « Guide de sélection des électrodes pH » à la page 26 pour plus d'informations.

R. Toutes les électrodes ne conviennent pas à tous les types d'échantillons. Consultez le « Guide de sélection des électrodes pH » page 26, ou contactez notre équipe de Spécialistes produits de Fisher Scientifi c pour plus d'informations

R. Les électrodes de référence utilisent des ions argent dans leur système de référence. Les protéines, les tampons Tris et les échantillons biologiques généraux réagissent tous avec les ions argent et cette réaction peut réduire la durée de vie de l'électrode.

R. Des solutions tampons neuves (de préférence certifi ées avec un étalon connu) doivent toujours être utilisées. L'âge de l'électrode doit aussi être pris en compte. Les électrodes ont une durée de vie utile comprise entre environ six mois et un an et doivent être considérées comme des consommables

R. Pour garantir des mesures précises et fi ables, nous recommandons toujours d'étalonner l’appareil avec trois tampons pH, normalement pH 4, 7 et 10. Toutefois, selon la précision dont vous avez réellement besoin, ceci peut être effectué en seulement deux points (par exemple 4 et 7, ou 7 et 10) ou jusqu'à cinq points sur les pH-mètres Fisherbrand Accumet. Lors du choix des tampons pH, il est important de s'assurer qu'ils englobent la plage de pH typique que vous prévoyez pour vos échantillons et de ne jamais étalonner avec des points séparés de plus de 3 unités de pH (par exemple, un étalonnage à 4 et 10 ne donnera pas de bons résultats). Quel que soit le cas de fi gure, effectuez toujours un étalonnage à pH 7.

R. Le pH-mètre doit être étalonné régulièrement avec des tampons neufs. S'il est utilisé de façon quotidienne ou hebdomadaire, cette opération doit être réalisée avant chaque utilisation. Si le pH-mètre est utilisé en permanence chaque jour, il peut être plus adapté d'étalonner au milieu de chaque journée dans le cadre d'une procédure d'étalonnage de routine.

R: La valeur du pH de tout échantillon varie avec la température. Il est donc toujours préférable de mesurer la température pour obtenir des mesures fi ables. Si vous mesurez à une température différente de celle à laquelle vous étalonnez, il peut être utile d'envisager une sonde à compensation de température automatique (« ATC ») ou une électrode intégrant ce dispositif. Les pH-mètres modernes ajustent la valeur de la pente de l'électrode à mesure que la température change afi n de garantir la précision des mesures.

R. Ceci ne pose généralement pas problème. De nos jours, la grande majorité des fabricants utilisent un connecteur « BNC » entre l'électrode et le pH-mètre pour les électrodes pH de référence. L'utilisation de sondes ATC peut s'avérer plus délicate car ces connecteurs ne sont pas standardisés et sont spécifi ques au fabricant.

R. Aussi souvent que possible. Le nettoyage et l'entretien permettent de prolonger la durée de vie de l'électrode. À noter que vous devez toujours éviter de laisser une électrode tremper dans une solution de nettoyage une fois qu'elle est propre. Ceci pourrait endommager l'électrode. Points clés à ne pas oublier

• Ne réutilisez jamais les tampons
• Ne polissez jamais l'ampoule
• Ne stockez jamais l'électrode à sec ou dans de l'eau déionisée
• N'agitez jamais l'échantillon ou les tampons avec l'électrode
• Ne recouvrez jamais le trou de remplissage de la chambre de référence pendant la mesure
• Changez régulièrement la solution de remplissage de référence

R. C'est possible. Ce qui compte est la valeur de la constante de cellule de conductivité (également appelée la valeur « K »). Une constante de cellule de 0,1 est nécessaire pour les échantillons d'eau pure. Chaque constante de cellule a une plage de détection limitée, ce qui signifi e que vous devez en choisir une dont la plage englobe celle que vous prévoyez pour votre conductivité d'échantillon. Voir ci-dessous des exemples de types d'échantillons, de valeurs de conductivité approximatives et de constantes de cellule convenables :

R. Il n'existe actuellement aucun système de connecteurs standard pour les pH-mètres et les cellules de conductivité, et tous les fabricants utilisent un système différent. Il est donc recommandé d'utiliser des cellules de conductivité du même fabricant que votre pH-mètre.

R. La température peut avoir un effet signifi catif sur la conductivité. L'augmentation de la température a clairement un effet sur les propriétés chimiques des solutions aqueuses. Ce facteur contribue à son tour à la conductivité de la solution. La conductivité varie typiquement de 1 à 3 % par degré Celsius

R. Les conditions de stockage des cellules de conductivité sont peu exigeantes par rapport aux autres types d'électrodes. Ces cellules peuvent être conservées dans de l'eau déionisée entre les mesures. Pour le stockage jusqu'au lendemain, il suffi t de les rincer dans de l'eau déionisée puis de les stocker à sec.

R. Ceci doit être effectué régulièrement, si possible avant chaque utilisation (si possible dans le cadre d'une procédure quotidienne d'étalonnage de routine).

R. Dans le contexte de la métrologie, la traçabilité permet de remonter le résultat d'une mesure à une autorité nationale telle que le National Institute of Standards and Technology (NIST, ou Institut national des normes et de la technologie), qui est une agence gouvernementale des ÉtatsUnis qui dépend du département du Commerce. Cela signifi e précisément qu'il existe une relation valide connue entre le produit et des normes internationales ou nationales reconnues, ainsi qu'une chaîne de référence parfaitement documentée et ininterrompue jusqu'à l'organisme régulant les outils de mesure. Le certifi cat d'étalonnage ISO 17025 qui est fourni de série avec nos produits est reconnu dans tous les pays européens.

R. Chaque unité Traceable™ est individuellement numérotée, étalonnée et certifi ée. Un certifi cat d'étalonnage Traceable™ à numéro de série unique vous garantit qu'un auditeur indépendant a vérifi é les méthodes, les procédures, les tests, les techniques et les pratiques de tenue de dossiers du laboratoire réalisant les tests d'étalonnage. L'A2LA (Association américaine pour l'accréditation des laboratoires) est largement reconnue au niveau international par des accords bilatéraux et multilatéraux, de même que par sa participation aux accords ILAC (International Laboratory Accreditation Cooperation) et MRA (Multilateral Recognition Agreement). Il n'est pas nécessaire de faire étalonner les produits sur place avant de les utiliser car toutes les instances dirigeantes européennes acceptent et reconnaissent totalement les certifi cats d'étalonnage Traceable™.

R. Les produits sont étalonnés pour une période de deux ans à compter de la date de fabrication. En général, nous vous conseillons de compter sur une période d'un an du fait de l'expédition et du stockage des produits.

R. La précision indique le degré de précision d'un instrument par rapport à une température connue. Étant donné qu'il est fort improbable qu'un instrument ait une précision exacte, cette valeur est généralement accompagnée d'une référence et d’une tolérance. La tolérance indique la valeur d'imprécision intrinsèque de l'instrument. Par exemple, si instrument possède une précision nominale de ±1 °C, cela signifi e que la valeur affi chée par l'unité peut être supérieure ou inférieure de 1 °C par rapport à la température réelle mesurée tout en restant dans la plage de tolérance et de précision indiquée pour l'unité.

R. La résolution d'un instrument est la plus petite valeur que ce dernier peut affi cher. Ainsi, un instrument dont la résolution est de 0,1 °C pourra affi cher une valeur à 0,1 °C près (par exemple 8,6 °C), tandis qu'un instrument dont la résolution est de 1 °C pourra seulement affi cher une valeur à 1 °C près (par exemple 9 °C).

R. Aucun des produits Fisherbrand Traceable™ n'a besoin d'un nouvel étalonnage ou d'une nouvelle certifi cation après un changement de pile. Ces produits sont traçables d'après les normes du NIST et le certifi cat d'étalonnage ISO 17025 qui est fourni de série avec les produits est reconnu dans tous les pays européens

R. Oui, des pelles de rechange sont disponibles (réf. cat. Fisher Scientifi c 15388764). Il s'agit de la pelle de rechange standard de 30 ml. Il existe aussi une grande pelle de rechange de 40 ml (réf. cat. Fisher Scientifi c 15398764).

R. Min/Max sont les températures les plus faibles (minimales) et les plus élevées (maximales) relevées depuis le dernier effacement de la mémoire du thermomètre ; Min/Max n'est PAS une fonctionnalité paramétrable. Sur certains produits, vous pouvez programmer les alarmes Haut (HI) et Bas (LO) de manière à ce que le produit émette une alarme si la température de ce que vous mesurez dépasse vos valeurs prédéfi nies. Plusieurs thermomètres fournissent également des relevés Internes/Externes (IN/OUT). Les températures Internes (IN) et Externes (OUT) font référence à différents capteurs, le capteur IN étant le capteur interne du produit et la sonde externe étant désignée comme OUT.

R. Les sondes en fl acon sont utilisées dans des réfrigérateurs dont la porte est susceptible d'être ouverte régulièrement. La sonde hermétiquement enfermée dans le fl acon donne une indication de la température du produit conservé dans le réfrigérateur plutôt que de la température de l'air, qui serait affectée assez rapidement par l'ouverture de la porte. La sonde de type vaccin utilise un concept similaire dans des dimensions proches de celles de la plupart des fl acons de vaccin. Ceci permet d'obtenir une indication précise de la température des vaccins stockés.

R. Les sondes en fl acon sont remplies d'une solution de glycol non-toxique généralement reconnue comme sûre par la FDA des États-Unis.

R. Les différents produits « Ultra » de la gamme Traceable™ sont étalonnés avec une précision de 0,4 °C aux points d'étalonnage testés. Des unités à « précision extrême » sont également disponibles. Ces unités sont étalonnées avec une précision de ±0,05 à 2 °C près des points testés. Elles sont disponibles pour les points 0 °C, 25 °C et 37 °C couramment testés. De plus, les thermomètres haute précision à sonde en platine ont une précision de ±0,1 °C sur toute la plage de température.

R. Les résultats inconstants, la faiblesse de l'affi chage ou l'absence d'affi chage sont des symptômes de la nécessité de remplacer les piles. Dans la plupart des cas, il suffi t de changer la pile pour que l'unité recommence à fonctionner normalement.

R. Lorsque vous comparez deux thermomètres, vous devez ajouter les tolérances des deux unités pour obtenir la quantité totale de variance existant dans ces unités, qui reste néanmoins conforme aux spécifi cations. Par exemple, si vous comparez deux unités identiques ayant une précision de ±0,1 °C, ces unités sont susceptible d'affi cher des températures qui diffèrent de 2 °C. Lorsque vous comparez les températures de thermomètres différentiels, il est important que les types de sondes que vous comparez soient équivalents.

R. Les flacons Fisherbrand sont presque tous fabriqués à partir de verre de première classe hydrolytique. Ce type de verre très dur est doté d’un faible coefficient de dilatation même lors d’écarts de température importants. Il démontre une excellente résistance chimique aux solutions neutres et acides et même aux solutions alcalines, grâce à sa faible teneur en alcali.

R. Tous les flacons Fisherbrand ayant une étiquette CleanPack apposée sur le devant de la boîte en polypropylène ont été conditionnés dans une salle blanche certifiée après être passés dans le four de recuit à environ 600°C. Cette étiquette garantit la propreté des flacons et l’absence de contamination pour que vous puissiez effectuer des analyses correctes. De plus, le film rétractable visible sur la partie inférieure de la boîte en polypropylène vous prouve que l’emballage est inviolable. Le couvercle vous permet également d’ouvrir et de refermer l’emballage à loisir sans risque de contaminer les flacons au cours de leur utilisation.

R. Les flacons silanisés sont utilisés pour réduire l’adsorption des composés polaires à la surface généralement polaire du récipient en verre. Certains composés tels que les acides aminés, les protéines ou le phénol ont tendance à réagir avec les groupes OH du verre, même si (et c’est souvent le cas en chromatographie) on utilise du verre de première classe hydrolytique. Au cours du processus de silanisation, la surface du verre est désactivée de telle sorte que les réactions éventuelles se produisant entre les composés polaires et le verre sont éliminées.

R. Le choix des bons septa dépend de l’application. Les septa ont presque tous un côté laminé en PTFE. Ce matériau est très résistant aux produits chimiques et forme une barrière inerte entre l’échantillon et le matériau vecteur du septa. Les matériaux de support possèdent des propriétés physiques et chimiques différentes comme la résistance thermique, les propriétés de refermabilité, la propreté, la dureté, l’épaisseur, etc. Pour vous aider à identifier les septa les plus adaptés à votre plage de températures et à votre application, merci de consulter le guide situé en page 13 de cette brochure.

R. Reportez-vous au tableau 4. Compatibilités chimiques des matériaux des flacons et des bouchons, pages 16 à 17 de cette brochure. Ce tableau est exclusivement pour référence. De nombreux facteurs sont susceptibles d’altérer la résistance chimique des flacons et des bouchons, et nous souhaitons vous rappeler qu’il vous incombe de réaliser un essai dans vos propres conditions pour vous assurer que le produit que vous utilisez est entièrement compatible.

R. L’essai de dureté des matières plastiques est fréquemment réalisé au moyen de l’essai Shore (duromètre). Cette méthode mesure la résistance des matières plastiques à l’indentation et fournit une valeur de dureté empirique. La dureté Shore est mesurée à l’aide des échelles Shore A ou D. C’est la méthode idéale pour les caoutchoucs ou les élastomères. On l’utilise aussi fréquemment pour les plastiques plus « souples » tels que les polyoléfines, les polymères fluorés et le vinyle. L’échelle Shore A est utilisée pour les caoutchoucs souples et l’échelle D pour les durs. La plupart des valeurs de dureté des septa sont mesurées avec l’échelle A, même si certaines duretés PE et PTFE font exception et sont mesurées avec l’échelle D. Les résultats obtenus sont utiles dans la mesure où ils indiquent la résistance relative de différentes qualités de polymère face au perçage. Il est ainsi plus simple de choisir le type d’aiguille qui pénétrera le septum et de savoir s’il nous faut une aiguille de plus petit calibre.

R. Les certifications sont de plus en plus importantes pour pouvoir reproduire davantage les processus et éviter les sources d’erreur potentielles dès le départ. La meilleure qualité, la constance et le contrôle de la qualité ont toujours été des critères extrêmement importants et sont mis en avant dans trois certifications : « Spécification certifiée », « Kits HPLC et GC certifiés » et « Kits LC/MS et GC/MS certifiés ». Pour plus d’informations, merci de consulter la page 15 de cette brochure.

R. L’offre actuelle du marché se compose de trois systèmes différents de scellage de flacons pour échantillonneur automatique :

• le bouchon à sertir de 8, 11, 13 ou 20 mm de diamètre,
• le bouchon à vis ; 8-425, 9 mm court, 10-425, 13-425, 15-425, 18 mm, 24-400, 24-414,
• le bouchon à clipser : 8 mm 11 mm, 13 mm.

Le bouchon à sertir offre le plus faible taux d’évaporation et donc la meilleure étanchéité, suivi par le bouchon à vis, puis les bouchons à clipser. Toutefois, les bouchons à vis et à clipser sont plus pratiques à manipuler, car aucune pince à sertir ou dessertir n’est requise. Si vous souhaitez manipuler un outil confortablement et pouvoir préserver l’intégrité de l’échantillon et la reproductibilité d’un flacon serti, le flacon à fermeture filetée est la meilleure alternative. Il offre le plus faible taux d’évaporation, reste bien en place et permet de réduire le nombre d’interruptions de l’échantillonneur automatique causées par la mauvaise manipulation des flacons.

Pour les systèmes de transport de flacons magnétiques d’échantillonneurs automatiques ultramodernes, vous aurez besoin de bouchons magnétisables, disponibles en bouchons à fermeture filetée et bouchons à sertir.

R. Le fait de réutiliser ou de laver les flacons représente certainement un risque pour l’intégrité de l’échantillon étant donné que la surface du flacon change au cours du processus de nettoyage (degré d’adsorption des composés critiques plus élevé) et que le retrait total des anciens analytes n’est pas totalement garanti. La contamination croisée et/ou les pics « fantômes » peuvent en résulter. Nous conseillons aux chromatographistes souhaitant ne pas compromettre l’intégrité de l’échantillon d’utiliser de nouveaux flacons et septa pour chaque analyse.

R. Le verre borosilicaté réduit le risque de contamination par adduits métalliques et permet de garantir la fiabilité des chromatogrammes même après avoir utilisé le produit pendant un certain temps.

R. Les produits LC-MS Optima™ (solvants, mélanges, additifs et réactifs) ont été spécialement développés pour permettre aux instruments les plus sensibles de fonctionner au maximum de leurs performances. Un test de gradient LC réalisé à l’aide d’un détecteur PDA garantit des lignes de base et un bruit de fond lisses. Il permet également de déterminer la présence d’impuretés d’ions positifs ou négatifs. La présence d’anions métalliques et d’analytes compliquant les spectres, notre processus de fabrication a été développé pour garantir un minimum d’impuretés. Nous proposons un produit de qualité LC-MS « standard » pour d’autres applications analytiques de routine.

R. Les différentes exigences des chromatographistes nous ont amenés à réfléchir à la manière d’améliorer notre processus de purification et à développer des séries de solvants et de tampons qui répondent aux besoins d’instrumentations spécifiques. Fisher Chemical propose une sélection de qualités de solvants développées, puis testées, afin d’optimiser les performances de la chromatographie et de correspondre à l’instrument et au type de détecteur.

Application de chromatographie	Instrument et type de détecteur	Qualité de solvant Fisher Chemical
UHPLC-MS	UHPLC combinée à un détecteur de masse	Optima UHPLC-MS
HPLC-MS avancée	LC and UHPLC combinées à un détecteur de masse	Optima LC/MS
HPLC-MS	LC combinée à un détecteur de masse	Qualité LC-MS
UHPLC	UHPLC combinée à un détecteur UV	Qualité de gradient UHPLC Gradient
Analyse de gradient HPLC avancé	Gradient LC combiné à un détecteur UV	Qualité HPLC avancée
Analyse de gradient HPLC	Gradient LC combiné à un détecteur UV	Qualité de gradient HPLC
HPLC (isocratique)	LC combinée à un détecteur UV	Qualité HPLC

Pour soutenir d’autres techniques de chromatographie de spécialité, nous proposons également une gamme de solvants de spécialité, tous spécifiés et testés comme il convient. Pour HPLC :

• Qualité de gradient avancée avec une faible dérive pour le développement de méthodes.
• Qualité HPLC pour la détection électrochimique.
• Qualité HPLC pour la détection par fluorescence.
• Qualité GPC (chromatographie sur gel).

R. FLe produit Fisher Scientific de réf. cat. 10596814 est conditionné dans des flacons PEHD pour des raisons de sécurité. Les flacons PEHD limitent les risques liés à une remontée de pression du monoxyde de carbone, un produit de décomposition naturel de l’acide formique. Les clients n’ont pas à s’inquiéter d’une éventuelle contamination provenant des plastifiants, car les flacons HDPE subissent un traitement de surface breveté qui vise à créer une barrière entre les surfaces du flacon et l’acide formique, ce qui empêche toute contamination. En laboratoire, il est préférable de stocker ce produit à une température de 4°C pour ralentir ce processus de décomposition naturel.

L’acide formique LC-MS Optima™ est également disponible dans des ampoules de 0,5 ml, 1 ml et 2 ml en verre (borosilicaté), Fisher Scientific réf. cat. 10780320, 10473038 et 10063427 respectivement. Remarque : les ampoules sont précoupées pour faciliter leur ouverture.

R. Non, le fait de stocker le produit temporairement à une température ambiante n’a aucun effet sur le réactif. Cependant, pour un stockage prolongé, nous insistons sur le fait que vous devez conserver le produit dans un endroit frais à 4°C afin d’en préserver plus longtemps l’intégrité.

R. La principale différence entre le verre borosilicaté et le verre sodocalcique réside dans le remplacement de la soude et de la chaux par de l'anhydride borique dans le processus de fabrication. Il présente une meilleure résistance à la chaleur et ne se dilate pas comme le verre sodocalcique, ce qui signifie qu'il est en mesure de supporter à la fois des extrêmes de froid et de chaud ; il est donc particulièrement bien adapté à la verrerie de laboratoire.

R. La verrerie est habituellement considérée comme adaptée à l'autoclave. Lors de l'autoclavage des récipients en verre, assurezvous que les bouchons sont desserrés. Lors du passage à l'autoclave, si les bouchons sont vissés très fermement, des différences de pression susceptibles d'entraîner la casse risquent d'apparaître. Ne passez pas à l'autoclave un équipement en verre endommagé, fissuré, craquelé ou rayé. De tels défauts diminuent la résistance thermique, et rendent l'équipement en verre plus enclin à la casse.

R. Même si les fioles Erlenmeyer et les béchers présentent des indications de volume approximatives, il existe toujours une incertitude de +/- 5 % concernant l'emplacement exact de la ligne de volume. Seuls cinq dispositifs de mesure volumétriques sont reconnus comme adaptés à un travail d'analyse précis et exact. Il s'agit des fioles volumétriques, des éprouvettes graduées, des burettes et des pipettes volumétriques ; elles sont classées dans deux catégories différentes, la Classe A et la Classe B.

R. La verrerie volumétrique de laboratoire, notamment les fioles volumétriques, les éprouvettes graduées, les burettes et les pipettes volumétriques sont produites et étalonnées conformément aux normes de l'ASTM ou American Society for Testing and Materials (l'ASTM est antérieure à d'autres organismes de normalisation tels que le BSI et le DIN). Elles sont disponibles en deux catégories différentes, la Classe A ou la Classe B. Les normes de l'ASTM définissent les tolérances selon lesquelles les marquages sont placés sur le verre. La Classe A est la catégorie correspondant à la plus grande précision et elle présente les tolérances les plus faibles, la Classe B présentant généralement des tolérances équivalant à deux fois celles de la Classe A.

R. Les pipettes volumétriques en verre Fisherbrand appartiennent à la Classe AS, qui a récemment remplacé la Classe A. La Classe AS correspond à la norme européenne et présente les mêmes précisions élevées et les mêmes tolérances conformes aux normes ISO et DIN correspondantes que la Classe A. Les pipettes sérologiques de la Classe AS présentent également une vitesse de distribution supérieure à celles de la Classe A (la lettre S désigne le mot allemand « schnell » qui signifie « rapide »). En conséquence de la vitesse de distribution accrue, un délai d'attente de cinq secondes doit être respecté lors du remplissage ou de la distribution du volume requis. Cela permet de s'assurer que le ménisque s'est stabilisé afin de conserver une bonne précision.

R. Le nettoyage par ultrasons est une bonne méthode pour nettoyer minutieusement la verrerie. Les laveurs à ultrasons utilisant des éléments chauffants sont les plus efficaces. En général, l'utilisation d'un laveur à ultrasons avec un détergent doux nettoie la plupart des résidus présents sur la verrerie. Lorsque vous utilisez ce type de matériel pour nettoyer la verrerie, assurez-vous que le matériel en verre est bien fixé et soyez très vigilant lors du chargement et du déchargement, car il s'agit d'une cause courante d'éclats et de casse.

R. Le verre ambré est utilisé en laboratoire pour la protection des produits chimiques et des matériaux sensibles aux UV. Le verre ambré bloque tous les rayonnements UV de 350 à 200 nm. La plage de rayonnement ultraviolet C utilisée pour tuer les microorganismes, entre 200 et 280 nm, est également bloquée. Cependant, les rayonnements UV ne sont pas tous bloqués par le verre ambré.

R. Les récipients en verre n'ont pas de date d'expiration ni de durée de conservation limite. Toutefois, vous devez contrôler régulièrement votre verrerie afin d'y rechercher la trace d'éventuels dommages risquant de compromettre sa sûreté ou sa précision. Si elle présente des signes de dommages importants, elle doit être mise au rebut et remplacée.

R. En général, les matériels en verre peuvent supporter des températures maximales de 500 °C. Cependant, lorsque la température dépasse 150 °C, vous devez prendre des précautions supplémentaires pour vous assurer que le chauffage et le refroidissement se déroulent de manière lente et uniforme. Si vous utilisez une plaque chauffante, assurez-vous que la plaque supérieure est plus large que la base du récipient à chauffer. De même, ne placez jamais un équipement en verre froid sur une plaque chauffante déjà très chaude. Chauffez progressivement à partir de la température ambiante. Si vous utilisez un bec Bunsen, réglez-le de manière à obtenir une grande flamme douce, qui chauffera le verre doucement et plus uniformément. Utilisez également une toile métallique avec centre en céramique pour diffuser la flamme.

R. Il n'existe pas de directive fixe en ce qui concerne le réétalonnage de votre verrerie, car cela dépend de la manière dont elle est nettoyée, manipulée et stockée. Normalement, la verrerie volumétrique a uniquement besoin d'être réétalonnée après une utilisation prolongée ou dans des conditions exigeantes, car elle peut affecter sa précision d'origine. Par exemple, envisagez de réétalonner votre équipement si :

• La verrerie est en verre sodocalcique et est en service depuis plus de cinq ans
• La verrerie est en verre borosilicaté et est en service depuis plus de dix ans
• La verrerie a été soumise à des températures supérieures à 150 °C
• La verrerie est fréquemment utilisée avec des acides ou des bases forts
• Les surfaces internes du verre présentent des signes de corrosion chimique, par ex., si elles deviennent mates

R. Pour obtenir des volumes précis, la méthode la plus sûre consiste à vous assurer que votre matériel en verre est propre. En ce qui concerne les burettes et les pipettes, la propreté du verre est indiquée par l'absence de toute « perle d'eau » sur la surface interne du matériel. Lorsque celui est propre, la solution présente un film fin et continu à l'intérieur de la verrerie.En général, un bref trempage dans une solution nettoyante chaude suffit à nettoyer les pipettes et la verrerie volumétrique. Éviter de faire tremper la verrerie trop longtemps, car si elle reste trop longtemps dans la solution nettoyante, une zone rugueuse risque de se former au niveau de l'interface verre/air, susceptible d'ôter toute utilité au matériel. Après un bref trempage (2 à 3 min), la verrerie doit être rincée abondamment à l'eau du robinet, et enfin 3 à 4 fois à l'eau distillée ou déminéralisée. N'utilisez pas de torchon pour sécher la surface du verre, laissez-le simplement sécher en le protégeant de la poussière. Il n'est pas nécessaire de sécher le verre dans le séchoir du laboratoire, mais si vous en avez un, utilisez-le. Non seulement il sèchera le verre plus rapidement, mais en plus, il le protègera de la poussière pendant le temps du séchage.

R. Les bouteilles en verre Fisherbrand n'ont pas de valeur nominale de résistance à la pression ; soyez donc extrêmement vigilant si vous utilisez la verrerie pour des applications sous pression. Fisher Scientific ne peut garantir aucun équipement en verre contre la casse lors de l'utilisation sous vide ou sous pression

R. Seuls les produits en polypropylène, en PTFE, en PC et en PMP (TPX) peuvent être autoclavés (le passage à l'autoclave est défini comme un cycle à 121 °C à 15 psi (1 bar) pendant 20 minutes). • Lors de l'autoclavage des bouteilles, assurez-vous toujours que les bouchons sont desserrés. Lors du passage en autoclave, les bouchons vissés très fermement peuvent entraîner un affaissement ou une déformation. De la même manière, ne soumettez pas les matériels volumétriques en plastique tels que les éprouvettes graduées, les fioles, etc. à des températures supérieures à 60 °C, car les températures élevées peuvent altérer la précision volumétrique.

R. Le LDPE et le HDPE présentent tous deux une température de fragilité de -100 °C et peuvent donc être utilisés pour la congélation d'échantillons trop grands pour les flacons cryogéniques standard. Prenez garde à ce qu'il reste suffisamment d'espace dans le récipient pour permettre la dilatation de l'échantillon. Nous pouvons notamment suggérer les références Fisher Scientific cat. 11735383,11775243 et 11957934.

R. Pour les applications dans lesquelles la visibilité est importante, les polymères tels que le polystyrène, le PET, le PMP ou le polycarbonate doivent être privilégiés. D'autres polymères, notamment le polypropylène et le polyéthylène sont translucides et parfois opaques ; ils ne sont donc pas bien adaptés à cette exigence

R. Pour connaître la compatibilité chimique spécifique de polymères en particulier, veuillez vous reporter au « Tableau de compatibilité chimique » pages 14 et 15.

R. Les détergents non alcalins ou à faible teneur en alcalis sont adaptés au nettoyage de la plupart des équipements en plastique. Notez cependant que les produits en polystyrène et en polycarbonate sont susceptibles d'être attaqués par les alcalis ; nous recommandons donc d'utiliser un détergent neutre. Vous devez également éviter d'utiliser des nettoyants ou des tampons à récurer abrasifs, qui risquent de rayer et d'affaiblir les surfaces

A. Le bon choix du septum pour un flacon ou une bouteille dépend de l'application. La plupart des septa sont lamellés d'un côté avec une couche de PTFE, qui présente une résistance élevée aux produits chimiques et forme une barrière inerte entre l'échantillon et le matériau de support sous-jacent. Les matériaux de support présentent des propriétés physiques et chimiques différentes, notamment en termes de résistance à la température, de propriétés de refermeture, de propreté, de dureté, d'épaisseur, etc. Le guide au verso vous aidera à identifier le septum le mieux adapté à votre application spécifique.

Septum

Les conditions spécifiques de votre application particulière permettent de déterminer quels sont les meilleurs matériaux de septum, comme illustré ci-dessous

Pour mieux visualiser les combinaisons de matériaux de septa les plus courantes du marché, veuillez consulter les images ci-dessous. Veuillez toutefois noter que les couleurs ne fournissent pas nécessairement une indication sur la nature du matériau du revêtement