Le dosage ELISpot
Analyse fonctionnelle de l’immunologie cellulaire
Dans des conditions optimales, le dosage immunospot lié à une enzyme (ELISpot) permet la visualisation de plusieurs produits sécrétoires d’une cellule réactive unique. Ainsi, la technique ELISpot fournit à la fois des informations qualitatives (type de protéine immunitaire) et quantitatives (nombre de cellules réactives). Grâce à la sensibilité inégalée de ce dosage, l’analyse de fréquence des populations de cellules rares (par exemple, les réponses spécifiques aux antigènes), auparavant impossible, est désormais relativement aisée. Des améliorations récentes apportées à la conception des microplaques, y compris l’utilisation de membranes ayant une fluorescence de fond réduite, ont renforcé l’application généralisée des dosages EliSpot.
Si l’on prend en compte la sensibilité du dosage, la simplicité d’utilisation et le coût, la plateforme EliSpot est probablement le meilleur choix pour le développement de dosages des cellules T multifonctionnelles pour les communautés de recherche, thérapeutiques et de diagnostic.
Optimisation des dosages ELISpot
Bien que les dosages ELISpot permettent de déterminer la fréquence d’événements très rares, l’interprétation des données peut devenir ambiguë lorsque le nombre de spots dans les puits contenant les antigènes est faible, lorsque le nombre de spots dans les puits de contrôle négatif est élevé, et plus particulièrement lorsque ces deux situations se produisent simultanément. Ainsi, la première tâche, avant même d’utiliser les statistiques, doit consister à optimiser les réactifs et les paramètres de base du dosage afin de maximiser le rapport signal-bruit. L’utilisation des paires d’anticorps très spécifiques et validées pour le dosage ELISpot est essentielle pour assurer la réussite du dosage, mais il reste nécessaire de faire preuve d’une considération adéquate et d’exécuter un certain nombre d’autres étapes pour garantir une performance optimale.
La popularité de ce dosage a connu une résurgence au cours de ces dernières années, alors que les chercheurs tentent d’obtenir une meilleure compréhension des réponses immunitaires dans diverses applications parmi lesquelles l’étude de la mémoire immunitaire et la mise au point de vaccins.
Choix de plaque (membrane)
Les plaques à membranes en PVDF (Références catalogue Merck n° MSIPS4W10, MSIPS4510, MAIPSWU10, MAIPS4510) sont recommandées plutôt que le format d’ester de cellulose mixte (Référence catalogue Merck n° MSHAS4510), en raison de la légère amélioration de la liaison des anticorps de capture et de la performance supérieure en matière de détection des spots, en particulier pour les applications par fluorescence. Le seul inconvénient des plaques en PVDF est l’extrême hydrophobie de ce matériau, une propriété qui peut nécessiter un pré-mouillage à l’alcool avant l’addition de l’anticorps capteur. La membrane en cellulose mixte étant hydrophile, les dosages ELISpot peuvent être réalisés sans pré-mouillage.
Contrôles positifs / négatifs
Les contrôles pertinents ont une importance cruciale pour mesurer les réponses spécifiques aux antigènes avec le dosage ELISpot. Les contrôles négatifs consistent généralement en des cellules cultivées sans stimuli, tandis que l’on ajoute souvent des activateurs polyclonaux de cellules T comme contrôles positifs pour confirmer la fonctionnalité des cellules et du dosage. Les contrôles positifs comprennent les anticorps anti-CD3 / CD28, la phytohémagglutinine (PHA) et la concanavaline A (ConA). Ces activateurs entraînent la sécrétion de nombreuses cytokines communes, dont IFNγ, IL-2 (Th1), IL-4, IL-5, IL-10 et IL-13 (Th2).
Les pools de peptides CEF (cytomégalovirus, virus d’Epstein-Barr, virus Influenza) disponibles dans le commerce sont un autre contrôle commun. Ils se composent de plusieurs épitopes provenant de chacun de ces trois virus, contre lesquels la plupart des individus sains (~90 %) possèdent des cellules T réactives au CD8.
Comme nous ne pouvons décrire que quelques aspects dans cet article, nous vous invitons à consulter notre Livre blanc sur le dosage ELISpot dans lequel le protocole de dosage fait l’objet d’une discussion plus poussée, en insistant sur les meilleures pratiques standard et les guides de résolution des problèmes.
